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細菌類原核生物酵母雙(單)雜交文庫構建

傳統的文庫構建方法和試劑盒均為針對真核生物的,真核生物的mRNA具有polyA結構,細菌類原核生物由于沒有polyA結構,使用傳統的文庫構建方法無法構建出原核樣本的酵母雙(單)雜交文庫。我們開發出針對原核生物的文庫構建技術,可以快速高效的構建出高質量原核樣本酵母雙雜交文庫,適用于多種用途。

  • 產品詳情

服務報價:3.5萬元整,免費贈送3個讀碼框處理,以確保蛋白可以正常表達。

可以選擇增加提供轉化到酵母的文庫,可以提供足夠100次篩選的酵母轉化菌液文庫,同時還會提供質粒文庫。

可選均一化處理,可以有效提高低豐度基因篩選檢出率。

服務時間:25個工作日內 


“自1989年Field等人建立了第一個基于酵母的細胞內檢測蛋白相互作用的系統以來,酵母雙雜交系統已經越來越多的應用于鑒定新的蛋白與蛋白相互作用,鑒定蛋白級聯底物以及鑒定突變對蛋白與蛋白結合的影響等。有文獻統計,目前已知的蛋白質相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交實驗發現的!” 而文庫篩選結果直接由文庫質量的好壞所決定,構建出高質量的文庫是得到好的篩選結果的關鍵因素。

       我們擁有多年的文庫構建經驗,已完成數千個各類文庫構建,所采用的技術以及試劑盒均為市場上高質量的文庫構建試劑,我們構建文庫的成功率為98%以上。關于我們的文庫構建產品,我們承諾的指標如下。
      上海海科結合多年的文庫構建經驗,強勢推出“All-Direct”文庫構建技術,我們的產品較其他構建方法(主要有takara的SAMRT方法和invitrogen的gateway方法),技術和質量上都具有一定的優勢。


一、產品質量標準與報價:
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      關于我們的文庫構建產品,我們承諾的指標如下: 

原始文庫庫容量大于1*10^7CFU;
平均插入片段大于1200bp ;
克隆陽性率大于95%。
 
二、技術特點與技術優勢:

       1.我們是采用同源重組的方法構建文庫,沒有經過任何的內切酶切割和連接過程,確保不會出現基因被酶切切斷的情況,能夠保證基因的完整性,而Clonetech的是用酶切連接的方式構建的。 

       2.由于我們采用的是重組的方式把cDNA重組到載體上,相對clonetech的SMART的T4連接酶的方法效率要高的多,我們承諾原始庫的庫容量在1*10^7以上。而且重組的方式假陽性很低,我們這里有的客戶一次測3萬個克隆,都沒有出現一個空載的情況,我們承諾陽性率大于98%,這是酶切連接的方法遠遠無法比擬的。 

       

文庫構建流程: 
1.細菌RNA的提取 
2.細菌mRNA的分離和cDNA合成(使用酶促法直接合成,不經過PCR擴增過程,比SMART方法質量大大提高) 
3.cDNA連接接頭 
4.cDNA按長度分離 
5.cDNA與酵母雙雜交文庫載體(pGADT7或者pDEST22)進行all-direct重組 
6.重組產物電轉化 
7.文庫檢測以及質粒提取
 
三、技術詳細比較:

1.與Clonetech(Takara)的SAMRT方法技術比較:

步驟SAMRT方法我們的All-Direct方法我們的優勢
基因與載體的連接酶切連接高效率的體外同源重組酶進行重組SMART方法使用酶切連接或者酵母細胞內的低效率重組的方式,進行片段與載體的連接,效率低下,假陽性率高,原始文庫的庫容在1*10^5CFU-1*10^6CFU.我們使用高效率的體外重組方式,大大提高重組效率,文庫的原始庫容大于1*10^7CFU.
酵母文庫的交付轉化到酵母細胞的文庫菌文庫混合質粒或者轉化到酵母細胞的文庫菌我們的產品可以自由選擇是交付文庫質粒或者轉化到酵母細胞的文庫菌,由于酵母菌不易長期保存,一般保存超過半年,文庫的質量就大大降低,建議以文庫質粒的方式長期保存,保存時間可以達10年以上。
文庫的用途酵母雙雜交,酵母單雜交酵母雙雜交,酵母單雜交,膜蛋白酵母雙雜交,酵母三雜交,細菌雙雜交,原核表達文庫,真核表達文庫,慢病毒包裝文庫…SMART方法由于其技術原因,只能構建酵母雙雜交和酵母單雜交文庫,而我們的系統可以構建出任何用途的文庫,只要有可用的載體系統即可。
文庫的多用途我們的文庫產品,可以方便的將文庫再通過簡單的方式轉移到其他任意載體上形成其他用途的文庫,而不需要重新構建文庫,大大提高文庫的使用范圍和降低文庫構建的成本。
文庫的使用次數30-80次至少500次以上SMART方法交付的是轉化到酵母細胞的文庫,且總量一般就50-100ml,只夠做幾十次的篩選,且用完就沒有了,不可以復制。我們交付的產品,包括了高庫容的大腸桿菌菌液和文庫質粒,如果全部使用完,至少可以夠做500次以上的篩選,且可以簡單復制,理論上是不可能用完的,大大提高經濟性。
文庫產品指標平均插入片段:600-800bp;
庫容量:1-5*10^5CFU;
空載率小于10%
平均插入片段大于1200bp;
庫容量大于1*10^7CFU;
空載率小于5%
我們的方法在原始庫容和平均插入片段上都比takara的SMART的方法高很多



2. 與invitrogen的構建方法比較


步驟invitrogen方法我們的All-Direct方法我們的優勢
基因與載體的連接gateway方法all-direct方法gatway方法與我們的all-direct方法都是基于高純度的同源重組酶,二者都屬于同源重組系統,在重組效率上沒有差異,差異在于,gateway方法需要經過兩步重組才能裝到目的載體上,這是由其技術缺點決定的,我們的all-direct方法是一步直接重組到目的載體上。由于gateway方法需要多一次重組,就需要多一次的重組反應以及文庫甘油菌的擴增和質粒提取,特別是文庫擴增階段,由于文庫的擴增會存在類似于PCR擴增的競爭性抑制,會造成低豐度的基因和長片段的基因丟失,每多做一次擴增和質粒提取,文庫的插入片段平均下降200bp左右。
文庫質粒提取液體培養鋪板擴增提取invitrogen方法使用液體培養的方式進行文庫的擴增和提取,由于搖菌過程中的競爭性抑制,會造成低豐度的基因和長片段的基因丟失,每多做一次擴增和質粒提取,文庫的插入片段平均下降200bp左右。而我們使用鋪板擴增的方式,確保每個克隆都是獨立生長的狀態,避免的基因間的競爭性抑制,大大降低基因丟失的情況。
文庫產品指標平均插入片段大于1000bp;
庫容量大于0.5*10^7CFU;
空載率小于5%
平均插入片段大于1200bp;
庫容量大于1*10^7CFU;
空載率小于5%
我們的方法在原始庫容和平均插入片段上都比invitrogen的方法高很多。






































四、交付結果:

       我們的酵母雙雜交文庫可以自由選擇使用pGADT7(Clonetech,推薦)或者pDEST22(invitrogen)載體,交付的產品如下:

產品名稱交付保準包裝形式儲存條件
酵母雙雜交文庫甘油菌庫容:大于1*10^7CFU
平均插入片段:大于1200bp
陽性率:大于95%
1.5ml螺旋管-80℃
酵母雙雜交文庫質粒大于500ug1.5ml螺旋管-80℃
文庫構建報告電子版Word和PDF格式常溫
文庫構建圖片電子版JPG格式常溫
轉化到酵母細胞的文庫甘油菌(可選)100ml
庫容大于:1*10^8CFU/ml
離心管-80℃


五、服務時間:

      25個工作日內,如需轉化酵母延長15個工作日。
備注1:該酵母文庫可以選擇增加均一化處理步驟,我們使用DSN法均一化方法,可以構建出高質量的均一化酵母雜交文庫,可以大大減少后續酵母篩選的工作量和篩選效率等。  

六、材料要求:
        客戶構建指定的酵母雙雜交cDNA文庫,由客戶提供組織、細胞或總RNA給我們即可:
 細胞樣本:細胞數量大于1*10^7 
 動物樣本:大于1g 
 植物樣本:大于2g 
 DNA:大于20ug 

七、客戶案例:

       目前我們已經成功完成數千個不用樣本的文庫構建,主要客戶為中國科學院上海植物生理生態研究所、上海交通大學、浙江大學、浙江省農科院、山東省農科院等多家單位完成酵母雙(單)雜交文庫構建服務,物種包括人、小鼠、大鼠、水稻、擬南芥、牡丹、稻飛虱、蘋果、油菜、小麥、貝殼、葡萄、真菌等。

八、文庫篩選:
       我們是國內極少數能同時提供文庫構建和文庫篩選的公司,對于酵母雙雜交篩選服務,您只需要提供誘餌基因序列即可,我們會進行以下工作,篩選的報價為3萬元整:

1.誘餌載體的測序驗證以及構建到雙雜交篩選載體上
2.誘餌基因的自激活檢測,檢測通過后繼續下一步實驗。
3.誘餌質粒轉化酵母細胞,驗證合格后再轉化文庫質粒
4.酵母篩選和3AT條件優化
5.篩選結果的測序
6.篩選結果的回轉驗證
7.篩選結果遞交:包括篩選報告,篩選結果的測序結果和blast結果,篩選結果克隆的質粒實物。

九、FAQ:

9.1. 如何選擇合適的文庫構建方法進行建庫?

      我們可以同時提供3種文庫構建方法的公司,這也足以看出我們公司的技術實力。
3種方法的比較如下:

      1) Clonetech 的SMART方法,該方法基本是被淘汰的,我們上文有詳細的技術比較,其為數不多的好處就是RNA的起始量可以很小,一般只需要幾ug即可,該方法成本很低,一般不建議選擇。

      2) Invitrogen的方法,該方法質量上較SMART方法要好很多,其對試劑的質量要求也很高,全部使用invitrogen的原廠試劑。我們全部使用invitrogen公司試劑進行構建,且做了一些技術改進,提高了文庫質量。該方法對起始的RNA要求較高,建議起始用量是大于200ug。但該方法有一個嚴重的缺點,就是需要進行兩次重組才能得到酵母文庫,而多一次重組就會多一次文庫擴增過程,會嚴重影響文庫質量。在上文中有詳細的技術比較和介紹。
       別的使用該方法建庫的公司,只能使用商業化的試劑盒構建文庫,沒有做改進。且由于進貨渠道的原因,試劑盒內的有些試劑他們是買不到的,質量就會大打折扣。比如DH10B 電轉化感受態細胞,這個感受態細胞轉化效率比國產的高出100倍以上。這個感受態細胞需要具有一堆的海關批文才能買到,其他公司由于沒有相關資質,是無法進口的,據我們了解,國內某公司居然會用化學轉化細胞代替電轉化,質量影響巨大。

       3) All-Direct方法,這個是我們的改進方法,是在invitrogen方法上做了重要改進,保留了其優點(不用PCR擴增,文庫保真度高),去除了其需要經過兩次重組的缺點,大大提高文庫質量。平均長度較invitrogen方法可以提高200bp,庫容量可以提高10倍以上。該方法對RNA的要求量和invitrogen方法一樣。

9.2. 海科生物提供的酵母雙雜文庫有哪些產品內容?

       我們提供的文庫產品,包含了文庫質粒(大于500ug)以及大腸桿菌文庫甘油菌。同時可以選擇提供轉化到酵母細胞的文庫甘油菌,我們會提供100只轉化到酵母細胞的文庫甘油菌,可以做100次的文庫篩選。
       其中文庫質粒可以使用共轉的方法進行文庫篩選,酵母細胞文庫甘油菌可以使用maiting的方法進行文庫篩選,根據老師的實驗習慣可以自由選擇,結果沒有任何差異的。

9.3. 如何檢測文庫質量?

       對于文庫的質量,一個簡單的金標準就是,樣本內的所有基因都在文庫里,且基因要有一半以上的全長基因,這個文庫就是合格的。
       對于文庫的檢測,可以針對我們交付的產品,做以下幾個方面的檢測:
       根據老師的樣本信息,選擇3-5個低拷貝的基因,設計合成引物,以我們提供的文庫質粒為模板,進行PCR擴增,如果低拷貝的基因都能擴增出來,高拷貝的就不會丟失,文庫質量即可以判斷為合格。
        對于我們提供的大腸桿菌文庫甘油菌,可以進行梯度稀釋后鋪板培養,第二天計算庫容量,同時挑取單克隆進行PCR擴增和測序檢測,以判斷插入片段長度和空載率。

9.4. 如何評價文庫質量?

       文庫質量的關鍵指標,主要是文庫庫容、空載率及插入片段平均長度。
       文庫的原始庫容肯定是越高越好,我們公司承諾的是大于1*10^7的庫容量,這個是原始庫容量,也就是沒有經過任何擴增過程,直接轉化出來的庫容量。比其他公司承諾的1*10^6的庫容量要高10倍以上,下面詳細解釋下庫容量的高低對文庫質量的影響:
       生物樣本,除了低等生物,目前研究比較多的物種,比如人,大鼠,小鼠,其基因數在5*10^4左右,文庫至少得100倍覆蓋,也就是庫容至少需要5*10^6以上。
       對于植物樣本,其基因數量比人的大很多,比如水稻樣本,其基因數量為人的2-3倍,小麥樣本,其基因數量為人的5-6倍,這樣就需要更多的文庫庫容量。對于水稻樣本,需要覆蓋100倍的基因數,要求的文庫原始庫容量是大于1*10^7以上。市場上別的公司提供的文庫只能覆蓋10倍左右,這么低的覆蓋度,必然造成大量基因的丟失。
       對于有的公司宣傳的,庫容量不是越高越好,這絕對是不負責任的忽悠,為自己的文庫質量不合格找不合理的借口。
       對于插入基因長度,別的公司一般平均長度就在800bp左右,我們公司可以承諾做到1200bp以上,這個差距是巨大的,下面再詳細介紹下插入片段長度對文庫質量的影響:
      一般的一個功能基因,其一般長度會在200個氨基酸以上,也就是編碼區在600bp堿基以上,裝入文庫的基因,除了編碼區,還會有5’UTR區,3‘UTR區以及polyA區域,這幾個部分加起來,基因的長度一般至少會在1000bp以上。由于文庫是個混合物,會存在競爭性抑制,短的基因過多,勢必會影響長度基因的比例,以及長的基因的表達豐度。
       我們的文庫產品,插入片段平均長度會在1200bp以上,短的會在1000bp左右。對于文庫篩選,不是說只要有基因的一個片段就可以了,蛋白質的功能需要多種因素的參與,如果插入基因過短,篩選到的結果只是一個基因片段,甚至是靠近polyA的一小段基因,這個結果的可行度在哪里?基本都可以認為是假陽性的結果的。
       對于有些公司宣稱的,文庫的基因插入片段不是越長越好,其實是對客戶的極其不負責任和不合理的忽悠,只是因為自己沒有技術做到更長的片段長度,而找的理由。

9.5. Mating和共轉兩種篩庫方法哪種好?

       共轉和maiting兩種方法,結果是一樣的,只是一個文庫質粒轉到酵母細胞的方法,對于后續的文庫篩選沒有區別的,可以根據老師的實驗習慣,自由選擇的。


9.6 公司文庫構建經驗有多久?

       本公司從事各類文庫構建和篩選長達10多年,特別是酵母文庫,是國內一直自己做文庫構建和篩選的公司。不像有的公司宣稱有10多年文庫構建經驗,實際上真實情況是其invitrogen系統的文庫構建經驗只有2-3年,2-3年前其所有的invitrogen系統文庫都是外包給某公司做的,只是個二道販子而已,由于自己一直做不好,才不得不一直外包。文庫構建和篩選,經驗很重要,長的經驗積累,可以保證產品質量和穩定性,一次成功率等。


十、客戶文章示例

核蛋白酵母雙雜交文庫客戶文章示例:

【1】Yeast-2-Hybrid data file showing progranulin interactions in human fetal brain and bone marrow libraries[J],Data in Brief, Volume 9, December 2016, Pages 1060-1062

【2】Zhenhai Yu, Yingying Ge, Lei Xie,et al. Using a yeast two-hybrid system to identify FTCD as a new regulator for HIF-1α in HepG2 cells[J],Cellular Signalling, Volume 26, Issue 7, July 2014, Pages 1560-1566

【3】Zhanyang Yu,1 Ning Liu,1 Yi Wang,2 Xiaokun Li,et al. Identification of Neuroglobin-interacting Proteins Using Yeast Two-hybrid Screening. Neuroscience. 2012 Jan 3; 200: 99–105.

【4】Cui LG, Shan JX, Shi M, et al. DCA1 Acts as a Transcriptional Co-activator of DST and Contributes to Drought and Salt Tolerance in Rice. PLoS Genet. 11, e1005617 (2015).

【5】Jing Ning, Baocai Zhang, Nili Wang, Increased Leaf Angle1, a Raf-Like MAPKKK That Interacts with a Nuclear Protein Family, Regulates Mechanical Tissue Formation in the Lamina Joint of Rice. The Plant Cell, Vol. 23: 4334–4347, December 2011.

【6】Raksha Singh, Mi-Ok Lee, Jae-Eun Lee, Jihyun Choi, Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiology, September 2012.Vol.160,

【7】X.F.Zha,M.Zhao, C.Y.Zhou, H.Z.Guo. Analysis of interaction between Bmhrp28 and BmPSI in sex-specific splicing of Bombyx mori Bmdsx gene. Genetics and Molecular Research 13 (3): 5452-5462 (2014)

【8】Chao Zhang, Rongchao Ge, Junwen Zhang, Identification and Expression Analysis of a Novel HbCIPK2-Interacting Ferredoxin from Halophyte H. brevisubulatum.PLOS. December 4, 2015.

【9】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.


酵母單雜交文庫客戶文章示例:

【1】Nobutaka Mitsuda,Miho Ikeda,Shinobu Takada,et al.Efficient Yeast One-/Two-Hybrid Screening Using a Library Composed Only of Transcription Factors in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol (2010) 51 (12): 2145-2151.

【2】Chang-Qing Yang1, Xin Fang1, Xiu-Ming Wu1, et al. Transcriptional Regulation of Plant Secondary Metabolism. Journal of Integrative Plant Biology 2012, 54 (10): 703–712

【3】Zejun Huang, Zhijin Zhang, Xiuling Zhang,et al. Tomato TERF1 modulates ethylene response and enhances osmotic stress tolerance by activating expression of downstream genes. FEBS Letters.Volume 573, Issues 1–3, 27 August 2004, Pages 110-116

【4】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.

膜蛋白雙雜交文庫客戶文章示例:

【1】Yasuyuki Nakamura, Jun Ishii, Akihiko Kondo. Rapid, Facile Detection of Heterodimer Partners for Target Human G-Protein-Coupled Receptors Using a Modified Split-Ubiquitin Membrane Yeast Two-Hybrid System.PLOS one. June 2013 , Volume 8 ,Issue 6.

【2】Zhe Ma, Hui Zhang, Junxi Zheng. Interaction between M-Like Protein and Macrophage Thioredoxin Facilitates Antiphagocytosis for Streptococcus equi ssp. Zooepidemicus.PLOS one. February 2012 ,Volume 7, Issue 2.

【3】Pratima Pandey and Singh Harbinder. The Caenorhabditis elegans D2-like dopamine receptor DOP-2 physically interacts with GPA-14, a Gαi subunit. Pandey and Harbinder Journal of Molecular Signaling 2012.

 中文論文:

【1】張云云,周 君, 李 曄. 可口革囊星蟲(Phascolosoma esculenta)酵母雙雜交文庫和鐵結合蛋白真核表達載體的構建. 海洋與湖沼,44卷,第6期。

【2】歐陽沫, 唐瀟,黃惜,袁紅梅。巴西橡膠樹HbICE1 基因酵母雙雜交誘餌載體的構建及互作蛋白的篩選。植物科學學報,2016,34(2): 255~262.

【3】岳珊珊,夏來新。酵母雙雜交篩選與果蠅C(2)M相互作用的蛋白。遺傳,2015.11,37(11)

【4】專利:一種結合串聯重復序列(TTTACAC)5的Dof蛋白質



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